Ir al contenido principal

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

PCR, preparación de la muestra, termociclador, ciclo de amplificación, electroforesis en gel de agarosa, tipos de PCR y usos.


Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).


La PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction) también llamada fotocopiado molecular es una técnica de laboratorio in vitro rápida y económica que imita la habilidad de la naturaleza de replicar ADN, generando múltiples copias (millones o miles de millones) de una secuencia especifica llamada secuencia blanco.

Este proceso de creación de copias fieles y exactas de la secuencia blanco se conoce como amplificación.

Permite detectar bajas concentraciones de organismos con altísima especificidad y sensibilidad.

Al final del procedimiento los productos de la PCR o amplificaciones son analizados en gel de agarosa mediante electroforesis.



Preparación de la muestra para PCR. 


En primer lugar, se debe extraer el ADN o ARN y luego debe resuspenderse. Para completar la mezcla de reacción debe introducirse a esta:


- Enzima Taq ADN polimerasa: Produce nuevas cadenas de ADN utilizando las existentes como molde. Es una enzima muy termoestable, es decir, soporta y opera a altas temperaturas, presentando su mayor actividad alrededor de los 70°C. Recibe su nombre de la bacteria tolerante al calor de la que se aisló, la Thermus aquaticus.


- Desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTP’s): Adenina, timina, citosina y guanina. Son las bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construirá las nuevas cadenas de ADN.

- Primers: También llamados indicadores o cebadores son moléculas de ADN de cadena sencilla cuyo tamaño por lo general oscila entre el 15 y 25 pares de bases con una cantidad de G-C no mayor al 55%. Se utilizan 2 de estos oligonucleótidos sintéticos altamente específicos cuya función es delimitar la secuencia blanco y son complementarios de esta.

- Tampón o buffer: Es la solución amortiguadora. El mas usado es el Tris-HCL con un pH de 8.

- Iones divalentes: Por lo general Mg2+.

Se utilizan tubos de microcentrífuga o Eppendorf de una capacidad de 0.2 ml.


Tubo Eppendorf
Tubo Eppendorf.




Termociclador.


También conocido como máquina de PCR o reciclador térmico de PCR, es el equipo especializado para realizar los ciclos de temperatura para llevar a cabo la PCR. Normalmente opera en rangos entre 4° y 96°C. 



Para evitar el fenómeno de condensación, lo cual disminuiría el volumen de las muestras, el termociclador suele incluir una tapa calentada constantemente a 103°. La disminución de la muestra concentraría los solutos, alteraría la actividad de la taq polimerasa y el apareamiento de los primers.




Ciclo de amplificación de la PCR 

La PCR consiste generalmente de alrededor de 20-35 ciclos divididos en tres pasos, a saber: 


- Desnaturalización: Ocurre por encima de los 90°C. La doble hélice de ADN se separa en las cadenas que lo constituyen. Esto ocurre debido a la ruptura de los puentes de hidrógeno que unen las bases nitrogenadas entre sí. Los enlaces covalentes de las desoxirribosas y fosfatos son muchos más fuertes y resisten las altas temperaturas. Si la cantidad de G-C es alta, se necesitará más tiempo para romper los 3 enlaces de esta unión. La unión A-T es de solo 2 enlaces.

- Hibridación (alineación o anillamiento): Entre 46 y 65°C. Los primers se unirán a la su secuencia complementaria de ADN formando el complejo templado-primers.

- Extensión (polimerización o elongación): A 72°C. La Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers agregando los dNTPs complementarios necesarios para completar la cadena de ADN. La enzima Taq Polimerasa tiene una función catalítica con una velocidad muy alta, como regla general, se dice que a una temperatura óptima la Taq polimerasa es capaz de polimerizar 1000 bases en un minuto.

Al finalizar cada ciclo la cantidad de ADN molde o templado se habrá duplicado. Al culminar todos los ciclos la temperatura desciende a unos 4° para el almacenamiento de los amplicones o productos de la PCR.

Lógicamente los tiempos y temperaturas dependen de la longitud del ADN que desea replicar, la polimerasa utilizada, etc.

El siguiente video es de lejos la explicación más concisa y fácil de entender:

Electroforesis en geles de agarosa.

La técnica de electroforesis en gel consiste en separar moléculas grandes en fragmentos según su tamaño por acción de una corriente eléctrica. Debe incluirse u estándar o marcador de peso molecular para poder determinar el tamaño de los fragmentos de la muestra de PCR.

Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza bromuro de etidio, el cual al exponerse a la luz UV emite una luz roja-naranja, ocurriendo por tanto un fenómeno de fluorescencia.


El bromuro de etidio es una sustancia tóxica irritante a los ojos, piel y mucosas, y altamente mutagénica por ser un agente intercalante, es decir se inserta en la molécula de ADN. La alternativa más utilizada es el SYBR Green (C₃₂H₃₇N₄S), esta cianina asimétrica no es intercalante, y además, es hasta unas 100 veces más sensible.






pb: Significa par de bases, del inglés base pair (bp). Es una unidad conformada por dos nucleótidos unidos por enlaces de hidrógeno. 




Tipos de PCR


PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minúsculos.

PCR in situ: permite la detección de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin tener que procesarla primero con técnicas de laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados de células.

PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de ADN a la vez y con una sola muestra. 

PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utiliza el VIH entre otros virus. 

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se añade un componente fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN detectado.


Usos prácticos de la PCR. 

A continuación algunos de los usos más comunes para la PCR: 

• Diagnóstico de enfermedades. 

• Establecimiento de la huella genética (paternidad). 

• Aislamiento de genes. 

• Secuenciación (ej. Genoma humano). 
• Mutagénesis. 
• Amplificación de ARN: RT-PCR (transcriptasa reversa). 
• Arqueología. 
• Investigaciones forenses. 


Fuentes:
Información obtenida en el aula a través de la profesora de la cátedra de Citología, Marian Nadales. Laboratorio Clínico Marian Nadales T.

Comentarios

Entradas más populares de este blog

Química Orgánica L.G. Wade - Vol 1 y 2

Libro de química orgánica para estudiantes universitarios.

Fisiología Médica Guyton & Hall. Ediciones 12 y 13.

Libro de Fisiología Médica de Guyton & Hall en PDF. Ediciones 12 y 13.

Principios de Bioquimica de Lehninger

Principios de Bioquimica de Lehninger en PDF.