Reacciones de reconocimiento de aminoácidos y proteínas

Reacciones de coloración y precipitación para el reconocimiento de aminoácidos y proteínas.

Aminoácidos

Todas las proteínas son polímeros, y los a-aminoácidos son los monómeros que se combinan para formarlas. Son ácidos carboxílicos con un sustituyente alfa-amino. El radical variable determina su solubilidad y permite clasificarlos.

Aminoácidos con cadenas laterales alifáticas. Glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina.

Aminoácidos con cadenas laterales que contienen hidroxilo o azufre. En esta categoría podemos situar a serina, cisteína, treonina y metionina.

Aminoácidos aromáticos. Existen tres: fenilalanina, tirosina y triptófano.

Aminoácidos básicos. Histidina, lisina y arginina.

Proteínas

Son macromoléculas complejas formadas por aminoácidos y polipéptidos, donde cada uno de los componentes está unido por enlaces de tipo peptídico.

Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida ocupando el lugar de máxima importancia de todas las biomoléculas ya que todos los procesos biológicos dependen de la presencia o actividad de este tipo de moléculas.

Reacciones de coloración.

Reacción de ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno).

Esta prueba es positiva con proteínas, péptidos y aminoácidos que tengan tanto el grupo amino como el grupo α-carboxilo libres o potencialmente libres y cuyo pH se encuentre entre 4 y 8. Produce una coloración que se conoce como azul o púrpura de Ruhemann que varía del azul al violeta intenso.

En principio es una reacción de óxido-reducción que produce Ninhidrina reducida y el iminoacido (molécula con un grupo imino y un grupo carboxilo), este último es hidrolizado para formar un α-cetoácido que luego se descarboxila. Finalmente el amoniaco (NH3+) reacciona con la ninhidrina.

Es una de las reacciones más sensibles para identificar aminoácidos en general, ya que detecta una parte de aminoácido en 1 500 000 partes de agua.

Ejemplos:

- La prolina y la hidroxiprolina dan una coloración amarilla.

- Cuando la prueba de Biuret da negativa pero la ninhidrina es positiva, existen entonces aminoácidos libres pero no proteínas.

Easter egg: La foto que sirve de portada a esta entrada es una prueba de ninhidrina (la mano sosteniendo los tubos púrpuras).

Método experimental para la reacción de ninhidrina

1. Disponer de 5 tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera: 

   - Tubo 1: ovoalbúmina - 1 mL

   - Tubo 2: tirosina - 1 mL

   - Tubo 3: glicina - 1 mL

   - Tubo 4: solución problema - 1 mL

   - Tubo 5: agua destilada - 1 mL

2. Añadir 0,5 mL de ninhidrina concentrada al 0.2% a cada tubo y agitar con suavidad.

3. Colocar los tubos en agua hirviendo por 5 minutos.

4. Retirar los tubos, dejar enfriar y observar la coloración.

La muestra problema tiene grupos carboxilo y amino libre o parcialmente libre, así como un pH entre 4 y 8. Puede ser una proteína, un aminoácido o una amina.

Reacción xantoproteica

Permite evidenciar la presencia de núcleos bencénicos en los aminoácidos aromáticos como es el caso de la fenilalanina, la tirosina y el triptófano. Las proteínas que tienen en su composición dichos aminoácidos también darán positivo. 

Se utiliza ácido nítrico concentrado que produce un precipitado blanco que luego se torna amarillo y luego, al ser alcalinizada la solución adquiere un color naranja. La positividad de la reacción se debe a nitroderivados fenólicos por acción del ácido nítrico sobre el anillo. La nitración ocurre con facilidad en anillos de benceno activados (tirosina y triptófano), caso contrario es el de la fenilalanina cuyo anillo no está activado.

Método experimental para la reacción de xantoproteica

1. Disponer de 5 tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera: 

   - Tubo 1: ovoalbúmina - 1 mL

   - Tubo 2: tirosina - 1 mL

   - Tubo 3: glicina - 1 mL

   - Tubo 4: solución problema - 1 mL

   - Tubo 5: agua destilada - 1 mL

2. Añadir 0,25 mL de ácido nítrico concentrado (HNO3) al 0.2% a cada tubo y agite con suavidad.

3. Colocar los tubos en agua hirviendo por 4 minutos.

4. Retirar los tubos, dejar enfriar y observe.

5. Adicione 1 mL de  hidróxido de sodio (NaOH) al 40% a cada tubo y observe.

La muestra problema no contiene anillos bencénicos por tanto los aminoácidos triptófano, tirosina y fenilalanina no están presentes en ella.

Reacción para aminoácidos azufrados

Se emplea para descubrir aminoácidos que tienen azufre en su estructura, tal es el caso de la metionina, la cistina y la cisteína, las proteínas que contienen estos aminoácidos también darán positivo. Se produce una coloración parda o negra debido a la formación de sulfuro de plomo.

La técnica se basa en separar mediante un álcali (NaOH) al azufre de los aminoácidos en forma de sulfuro de sodio (Na2S) el cual reacciona con una solución de acetato de plomo formando el sulfuro de plomo.

Método experimental para la reacción de aminoácidos azufrados

1. Disponer de 4 tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera: 

   - Tubo 1: ovoalbúmina - 1 mL

   - Tubo 2: cisteina - 1 mL

   - Tubo 3: solución problema - 1 mL

   - Tubo 4: agua destilada - 1 mL

2. Añadir 0,5 mL de ácido hidróxido de sodio (NaOH) al 40% y agite con suavidad.

3. Añadir 0,25 mL de acetato de plomo y agite con suavidad.

4. Colocar los tubos en agua hirviendo por 5 minutos.

5. Retirar los tubos, dejar enfriar y observe.

La muestra problema no contiene azufre por tanto los aminoácidos metionina, cistina y cisteína no están presentes en ella.

Reacción de Hopkins-Cole (ácido glioxílico)

También llamada prueba de Adamkiewicz, se utiliza para determinar la presencia de triptófano y de aquellas proteínas que lo contienen. El anillo de indol reacciona con el ácido glioxílico en presencia de un ácido fuerte (ácido sulfúrico) para formar un producto cíclico color violeta. Dicho anillo solo puede aparecer en presencia de triptófano pues es el único aminoácido con el grupo indol.

Método experimental para la reacción de Hopkins-Cole (ácido glioxílico)

1. Disponer de 4 tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera: 

   - Tubo 1: ovoalbúmina - 1 mL

   - Tubo 2: triptofano - 1 mL

   - Tubo 3: solución problema - 1 mL

   - Tubo 4: agua destilada - 1 mL

2. Añadir 1 mL de reactivo de Hopkins-Cole.

3. Adicione a cada tubo lentamente por las paredes  2 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4). Evite mezclar los líquidos. No agite. Observe.

No se visualiza el anillo de indol en la muestra problema por tanto no hay presencia de triptófano en ella. Esto ya lo sabíamos de la prueba xantoproteica.

Reacción de Biuret

Al igual que la reacción de ninhidrina, el biuret es una reacción general de coloración de proteínas. Permite detectar el enlace peptídico, por tanto solo los péptidos y proteínas dan positivo, mientras que los aminoácidos y dipeptidos son negativos en esta prueba. La positividad se da al producirse un color rosado en presencia de iones cobre (Cu+2) y medio alcalino.

Las proteínas de elevado peso molecular dan una coloración violeta mientras que los péptidos formados por más de 3 aminoácidos dan una coloración rosa muy clara.

Método experimental para la reacción de Hopkins-Cole (ácido glioxílico)

1. Disponer de 5 tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera: 

   - Tubo 1: ovoalbúmina - 1 mL

   - Tubo 2: gelatina - 1 mL

   - Tubo 3: glicina -  1 mL

   - Tubo 4: solución problema - 1 mL

   - Tubo 5: agua destilada - 1 mL

2. Añadir a cada tubo 1 mL de hidróxido de sodio (NaoH) al 20%.

3. Añadir a cada tubo 0,25 mL de sulfato de cobre al 0,5%.

4. Agitar suavemente, observar.

No hay enlaces peptídicos en la muestra problema. A juzgar por la prueba de ninhidrina positiva estaríamos en presencia de un aminoácido, posiblemente glicina.

Reacciones de precipitación

Precipitación por ácidos fuertes (Robert)

Los ácidos fuertes como el ácido nítrico producen cambios conformacionales y estructurales de las proteínas debido a la ruptura de enlaces de hidrógeno intra e intercatenarios, como consecuencia, las proteínas precipitan o coagulan por un fenómeno de desnaturalización.

La prueba es positiva cuando se agregan partes iguales del reactivo de robert y de solución proteica, aparece un halo de precipitación blanco en la interfase de los líquidos. Esta reacción se utiliza comúnmente en laboratorios clínicos para evidenciar la presencia de proteínas en la orina.

Composición reactivo de robert: 1 parte de ácido nítrico y 5 partes de solución saturada de sulfato de magnesio.

Método experimental para la precipitación por ácidos fuertes (robert)

1. Disponga 4 tubos de ensayo y añada 2 mL de reactivo de robert a cada uno.

2. Seguidamente agregue con sumo cuidado, lentamente y por las paredes del tubo evitando que los líquidos se mezclen los siguientes volúmenes:

   - Tubo 1: ovoalbúmina - 2 mL

   - Tubo 2: orina normal - 2 mL

   - Tubo 3: orina patológica - 2 mL

   - Tubo 4: solución problema - 2 mL

3. Observar

Aquí se evidencia la precipitación proteica en la muestra problema y en la orina patológica. Esta imagen se tomo con una muestra problema diferente (una proteína) a la utilizada en las pruebas de coloración y precipitación por calor. 

Precipitación por calor

Busca la desnaturalización de las proteínas mediada por altas temperaturas. Se formará un coágulo o precipitado.

Nota: La ovoalbúmina coagula a 80 C (desnaturalización irreversible).

Método experimental para la precipitación por calor

1. Disponga 2 tubos de ensayo y proceda así: 

   - Tubo 1: ovoalbúmina - 2 mL

   - Tubo 2: Solución problema - 2 mL 

2. Calentar por 5 minutos

3. Observar

No hay precipitación en la muestra problema, lo cual indica que no es una proteína. A juzgar por la prueba de ninhidrina positiva estaríamos en presencia de un aminoácido, posiblemente glicina.

Fuentes:
- Principios de Bioquímica. Lehninger, A. 5ta. Edición.
- Bioquímica Mathews, Christopher. 4ta Edición.
- Bioquímica del Harper-Murray R, Mayes P, Granner D, Rodswel V. 29 Edición.
- Wikipedia: Iminoacido - Rx Xantoproteica - Indol  - Cisteína - Rx de Hopkins-Cole
- PUCP Blog: Quimica de los alimentos - Reacciones de reconocimiento de proteinas.
- Reconocimiento de proteínas - Quimica 6to Ingeniería.
- Guia de trabajos practicos "Bioquimica general". Profesores del Departamento de Bioquímica de la escuela de ciencias biomédicas y tecnológicas de la Universidad de Carabobo. Marzo 2013.